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雞馬立克氏病核酸試劑盒

產(chǎn)品型號(hào):

廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家

訪問量:1123

更新時(shí)間:2020-04-09

簡要描述:

?雞馬立克氏病核酸試劑盒

馬立克氏?。∕DV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病,其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤和增大,引起肢(翅)麻痹,以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義.

詳細(xì)說明:

雞馬立克氏病核酸試劑盒

【預(yù)期用途】

?雞馬立克氏病核酸試劑盒

馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病,其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤和增大,引起肢(翅)麻痹,以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義.

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)MDV高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含MDV基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

注:陰性對(duì)照為基因組DNA,陽性對(duì)照為MDV經(jīng)滅活處理的核酸提取物。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下:

(1) 咽喉拭子,采取時(shí)要將拭子深入喉頭及上愕裂來回刮3次~5次,取咽喉分泌液;

(2) 泄殖腔拭子,將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便;

(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用。

2.血液或血清樣品:使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。

3.肌肉或內(nèi)臟樣品:取少量樣品(2~3克)于研缽或勻漿器中研磨,然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。

4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

5.標(biāo)本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于2~8冷藏過夜保存;如需長期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下,避免反復(fù)凍融

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

(2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)(1T)+陽性對(duì)照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

PCR反應(yīng)液

17.5 μL

混合酶液(Taq酶+UNG酶)

 2.5 μL

(3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽性對(duì)照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽性對(duì)照品,終體積為25μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR(PCR擴(kuò)增區(qū))

(1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

(2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

 

 

反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集MDV熒光信號(hào)

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

UNG處理

 50:2分鐘(min)

1

預(yù)變性

 95:3分鐘(min)

1

預(yù)擴(kuò)增

95:5秒(s)

5

55:40秒(s)

PCR擴(kuò)增

95:5秒(s)

40

55:40秒(s)

(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào))

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

(1)陽性對(duì)照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

(2)陰性對(duì)照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

(1)陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

(2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

(3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

 

【預(yù)期用途】

馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病,其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤和增大,引起肢(翅)麻痹,以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義.

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)MDV高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含MDV基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

注:陰性對(duì)照為基因組DNA,陽性對(duì)照為MDV經(jīng)滅活處理的核酸提取物。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下:

(1) 咽喉拭子,采取時(shí)要將拭子深入喉頭及上愕裂來回刮3次~5次,取咽喉分泌液;

(2) 泄殖腔拭子,將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便;

(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用。

2.血液或血清樣品:使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。

3.肌肉或內(nèi)臟樣品:取少量樣品(2~3克)于研缽或勻漿器中研磨,然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。

4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

5.標(biāo)本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于2~8冷藏過夜保存;如需長期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下,避免反復(fù)凍融

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

(2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)(1T)+陽性對(duì)照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

PCR反應(yīng)液

17.5 μL

混合酶液(Taq酶+UNG酶)

 2.5 μL

(3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽性對(duì)照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽性對(duì)照品,終體積為25μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR(PCR擴(kuò)增區(qū))

(1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

(2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

 

 

反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集MDV熒光信號(hào)

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

UNG處理

 50:2分鐘(min)

1

預(yù)變性

 95:3分鐘(min)

1

預(yù)擴(kuò)增

95:5秒(s)

5

55:40秒(s)

PCR擴(kuò)增

95:5秒(s)

40

55:40秒(s)

(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào))

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

(1)陽性對(duì)照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

(2)陰性對(duì)照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

(1)陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

(2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

(3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

 



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