1. 細(xì)胞難脫離
• 培養(yǎng)基內(nèi)含有某些抑制成分(例如血清)使細(xì)胞解離液失活。
解決對策:在加入細(xì)胞解離液(dissociating solution)之前,先用DPBS潤洗細(xì)胞兩次或者是直接用細(xì)胞解離液潤洗細(xì)胞。
• 選用的細(xì)胞解離液太弱。
解決對策:提高酶濃度、EDTA濃度,或者使用作用更強(qiáng)的細(xì)胞解離液(如dispase, collagenase),或者是把細(xì)胞置于37°C孵育以提高解離液的活性。
• 細(xì)胞達(dá)到100%匯合時(shí)間太久,細(xì)胞間連接變得非常牢固,阻礙了解離液滲透到細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)接觸的界面。
解決對策:當(dāng)細(xì)胞達(dá)到大約70%-90%匯合時(shí),即進(jìn)行傳代。
2. 細(xì)胞脫離下來后聚集成團(tuán)(Clumps)
• 分離過程太劇烈,導(dǎo)致細(xì)胞裂解釋放基因組DNA。原因有二:一,移液槍吹打太劇烈;第二,選用的細(xì)胞解離液太強(qiáng)或有毒性,導(dǎo)致pH或滲透壓異常。
解決對策:往細(xì)胞懸液內(nèi)加入一滴無菌DNAse (1 mg/ml in water)使DNA鏈斷裂。在隨后的操作中,注意溫和吹打細(xì)胞懸液,縮短孵育時(shí)間,換用弱一點(diǎn)的細(xì)胞解離液或者在低一點(diǎn)的溫度下孵育。
• 如果收集的單細(xì)胞懸液沒有立即加入培養(yǎng)基稀釋并接種到新的培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng),而是在室溫放置一段時(shí)間。這種情況下,細(xì)胞也有可能會聚集成團(tuán)。
解決對策:將細(xì)胞懸液放置在冰上。
• 細(xì)胞懸液離心去除多余解離液時(shí),離心太劇烈或時(shí)間過久。
解決對策:確保溫和離心,推薦使用125g離心10 min。
3. 細(xì)胞重新貼壁困難
• 細(xì)胞解離過程持續(xù)時(shí)間過長,使得存在于細(xì)胞膜上的細(xì)胞附著所必需的蛋白剝離。
• 培養(yǎng)基內(nèi)缺少足夠的血清或黏附因子(常見于無血清培養(yǎng)基)。
解決對策:往培養(yǎng)基內(nèi)添加黏附因子或者選用蛋白(collagen, poly-L-lysine, fibronectin, gelatin, etc.)包被過的培養(yǎng)容器。
• 未失活細(xì)胞解離液或者離心去除細(xì)胞解離液。
解決對策:在培養(yǎng)基內(nèi)添加額外的血清或特異性酶抑制劑(例如,大豆胰蛋白酶抑制劑)中和細(xì)胞解離液。亦或使用125g離心5min去除細(xì)胞解離液,然后使用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
4. 細(xì)胞活力低
• 細(xì)胞分離過程太劇烈
解決對策:自行摸索解離時(shí)間。
• 配制細(xì)胞分離液所用的平衡鹽溶液(Balanced Salt Solution)pH或滲透壓異常。
解決對策:測量pH或滲透壓或直接換一瓶新的平衡鹽溶液。
• 在重新接種之前,單細(xì)胞懸液以非常高的細(xì)胞密度在室溫放置時(shí)間過長。
解決對策:將細(xì)胞懸液置于冰上。
• 培養(yǎng)基選擇不恰當(dāng)。
解決對策:推薦使用與原代細(xì)胞相配套的專屬培養(yǎng)基。